免疫印迹的基本原理、实验步骤及 FAQ | RIP专题
免疫印迹（Western Blot） 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的 NC 膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如 5%BSA 或脱脂奶粉溶液）处理，封闭 NC 膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理 NC 膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的 NC 膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG 的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
02实验步骤示意图SDS-PAGE 电泳(不用染色!)
使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。
1. Western blot 结果中的背景为什么较高?
可能的原因及建议
1) 膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。Abcam 推荐 5% 脱脂奶粉、3% BSA 或血清封闭 30 分钟。这些可以包含在抗体缓冲液中。
2) 一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
3) 一抗孵育的温度偏高——建议 4℃结合过夜。
4) 膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
5) 检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
6) 二抗与封闭剂非特异性结合或反应——设置二抗对照(不加一抗)。
7) 一抗或二抗与封闭剂有交叉反应——在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温 -20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生 高背景。使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂。
8) 未结合蛋白质洗涤不充分——增加洗涤次数。
9) 膜的选择导致的高背景——NC 膜比 PVDF 膜背景低。
2. Western blot 结果中杂带较多
可能的原因及建议
目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
一抗不纯——纯化抗体
一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。
细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同——使用原始未传代的细胞株，和现在的细胞株一起做平行对照实验。
检测到未经报道过的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而结构不同的蛋白——查阅其它文献报道，或 BLAST 搜寻，使用说明书推荐的细胞株或组织。
条带为非特异性条带——应用封闭多肽来区分特异性和非特异性条带，只有特异性条带能被封闭从而消失。
靶蛋白形成多聚体——SDS-PAGE 电泳上样前，煮沸 10 分钟而不是 5 分钟，使蛋白质解聚。
结果中无信号或显示信号弱
可能的原因及建议
1) 检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
2) 检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，不 低于20-30ug，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
3) 转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
4) 抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
5) 一抗孵育时间不足或一抗不足或一抗失效——建议 4℃结合过夜，使用高浓度抗体，使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低。
6) 二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。
7) 洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1%的弱去垢剂 Tween-20。
8) 封闭剂和一抗或二抗有交叉反应——使用使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。
9) 二抗受叠氮钠抑制——避免叠氮钠和 HRP 标记抗体一起使用。
3. 其它现象：
1) 膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合，过滤封闭剂。
2) 反白（条带显白色）——目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高，稀释抗体的浓度。
3) 蛋白分子量偏低或偏高——胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。
4) 分子量蛋白标准条带呈黑色——抗体和分子量蛋白标准发生了反应，在分子量蛋白标准和第一个样品之间增加一个空白条带。
5) 目的条带染色过低/过高——分离不彻底，改变凝胶比例：分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶。
6) 相同的蛋白杂交出现大小不均匀条带——制备凝胶时凝胶凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均匀，参照凝胶的配方，在凝胶中加入适量 TEMED，放置时在凝胶顶部加入适量 0.1% SDS（水稀释）以防凝胶变干。
4. “微笑”条带
1) 迁移速度过快——降低电泳电压。
2) 电泳温度过高（改变了 pH 值和迁移速度）——降低迁移速度或低温电泳(冷库或冰上)。
5. 凝胶染色不均匀
1) 细菌污染——4°C 保存抗体并使用新鲜的缓冲液浸泡凝胶。
2) 抗体量不足——确保在振荡孵育时抗体充分浸没膜。
6. TBS 与 PBS 的区别
PBS 的缓冲能力强于 TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS 在 PH7.0 以下缓冲能力较弱（不过 PBS 易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选 TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选 PBS。
Western blot 中使用 TBS 和 PBS 均可，只是要根据需要选择合适的浓度。
7. Western 是否可以同时加两种或者多种一抗
通常情况下只加一种一抗。做 Western 在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL 显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL 显色、压片、洗片。
8. PVDF 与 NC 膜的区别
PVDF 膜价格较贵，可重复使用，但结合能力较强。
NC 膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性较 PVDF 膜差，韧性也不如 PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。
9. Western 一抗的选用
理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。
10. Western 抗体和 ELISA 抗体的区别
一般来说用于 western 的抗体主要识别氨基酸序列特异性；而可用于 ELISA 的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。
做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。
11. “短路”现象的产生和处理
如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的 1.5-3 倍都是正常的。一般 Buffer 和滤纸选的对就不会短路。
12. Western Blot 的染色
1) 阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到 1.5μg，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红 S 和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
2) 胶体金，灵敏度高，检测范围可到 pg 级，但染色比稳定。
3) 生物素化灵敏度位于 1、2 之间，可用于任何一种膜。
13. 大分子量蛋白转移效率低的解决方法
可以在转移缓冲液中加入 20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇能增加蛋白质和 NC 膜的结合能力，同时可以延长高分子量蛋白质转移时间；转移缓冲液加入终浓度 0.1% SDS，也是为了增加转移效率；选用优质的转移膜，或使用小孔径的 NC 膜（0.2 微米）；使用戊二醛交联。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。
14. DAB 显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理
DAB 显色在辣根过氧化酶的作用下能形成一种灰褐色的产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，DAB 的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。
15. 酶显色与荧光显色的优缺点
免疫酶技术就是用酶标记已知抗体（或抗原），然后与组织标本在一定条件下反应并结合，结合形成的复合物中所含有的酶分子遇到底物时，会催化底物水解、氧化或还原，从而发生显色反应。免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。
免疫荧光技术中的荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，但免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法。酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察。
16. 为什么蛋白质印迹条带大小与预期的不同？
蛋白质印迹是一种基于蛋白质大小来分离蛋白质的技术。一般来讲，蛋白质越小，在胶上的迁移速度越快。但迁移速度也受其它因素的影响，因此，观察到的实际条带大小可能与预测的不同。常见的因素包括：
1) 翻译后修饰 - 例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白质大小。
2) 翻译后切割 - 例如，许多蛋白先被合成为前蛋白，然后被切割产生活性形式，例如前半胱天冬酶。
3) 剪接变体和异形体 - 可变剪接和异形体可能从同一基因产生不同大小的蛋白质。
4) 相对电荷-氨基酸（带电和不带电）多聚体组分，例如蛋白质的二聚化。这种情况通常在还原条件下需要防止，但强相互作用会导致较大的条带出现。
17. 应该上样多少样品？
细胞裂解物、膜裂解物和核裂解物：每孔上样 20 至 30 µg 总蛋白。
这可能需要根据测试样品中的蛋白质表达水平进行一些优化。纯化蛋白（重组或内源）：上样 10 至 100 ng 蛋白。
18. 检测重组蛋白时难以获得条带。为什么？
抗体检测重组蛋白质时，存在难以克服的困难，有必要加以考虑。我们推荐确保样品中表达的重组蛋白包含所用抗体的免疫原序列。
同时，如果重组蛋白带有标签，标签可能阻止抗体接近表位。尽可能让标签位于重组蛋白的 C 或 N 末端，以降低这种情况发生的可能性（而不是位于蛋白质的阅读框中间）。
在蛋白质印迹中检测重组蛋白时，我们始终推荐运行内源阳性对照。
19. 样品需要还原和变性吗？
我们推荐查看数据表获取更多详情。Abcam 抗体将仅在还原和变性条件下进行测试，除非数据表中另有说明，我们推荐使用还原和变性条件。
在一些情况下，Abcam 抗体也将在非还原条件下进行测试，在这种情况下，我们将在数据表上详细说明（参见应用备注部分或 Abreviews）。如果我们有表明抗体在某种或其它条件下无效的数据，数据表会加以说明。
20. 牛奶和 BSA 封闭有区别吗？
抗体可能对封闭剂敏感，我们推荐查看数据表确定是否有数据表明抗体在 BSA 还是牛奶中效果更好。如果有，Abcam 将在数据表中加以说明。
一般来讲，BSA 会产生更清晰的结果，因为 BSA 含有较少的蛋白，因而抗体较少与其发生交叉反应。但并非总是如此，有些抗体在牛奶中的效果更好，因为牛奶含有更多种类的封闭蛋白，能封闭更多不同类型的蛋白质。
21. 能否用室温下孵育一抗 1 小时代替 4 ℃ 过夜孵育？
蛋白质印迹中一抗孵育时间需要最终用户进行优化。一般来讲，4 ℃ 过夜孵育将产生更高效、更特异的染色。但许多抗体在室温下孵育 1 或 2 小时效果也非常好。
我们推荐查看数据表上关于合适孵育时间的数据（参见可用的Abreviews、出版物和图像数据）。
22. WB不建议分装抗体，可能会导致抗体失效；
四、参考来源：
1. http://www.detaibio.com/material-western-blot-faq.html
2. https://www.abcam.cn/products?keywords=westernblot